MS/MS)电玩城游戏大厅:测定猪肉样品中新型兽药泰拉霉素残留的方法,μL注入液相色谱-串联质谱仪

 仪器摆设     |      2020-02-09

规范性引用文件  《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》  原理  鸡蛋中残留的金刚烷胺用1 %乙酸乙腈溶液提取,正己烷液液分配去脂,液相色谱分离,串联质谱正离子模式测定,内标法定量。  一、仪器设备  1、液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI);  2、分析天平:感量0.000 01 g、0.01 g;  3、均质机; 4、涡旋混合器;  5、离心机:转速8 000 r/min; 6、氮吹仪。  二、质谱参考条件  离子源:电喷雾离子源。  扫描模式:正离子扫描。  检测方式:多反应离子监测(MRM)。  脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮或其他合适气体。  锥孔电压、碰撞能量等应优化至最优灵敏度。监测离子参数情况见表2。  1.jpg  三、定性测定  通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5 %;试样特征离子的相对丰度比与浓度相当标准溶液的相对丰度比一致,相对丰度比偏差不超过表3的规定,则可判断试样中存在金刚烷胺残留。

本标准适用于水溶肥料、复混肥料、掺混肥料、配方肥料中10种植物生长调节剂[复硝酚钠(2-硝基苯酚钠、4-硝基苯酚钠、5硝基邻甲氧基苯酚钠)、萘乙酸、脱落酸、赤霉酸、氯吡脲、烯效唑、多效唑、2,4-D]的检测。 规范性引用文件 《GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法》 一、相关仪器 1、液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源和数据处理机。 2、漩涡混合器。 3、高速离心机:最高转速不低于6000r/min。 4、分析天平:精度0.1mg。 5、金属试验筛:0.5mm。 6、超声波清洗器。 7、有机相微孔滤膜:0.22μm。 二、质谱操作条件: a)电离方式:电喷雾电离,氯吡脲、烯效唑、多效唑采用正离子模式(ESI+),复硝酚钠、萘乙酸、脱落酸、赤霉酸、2,4-D采用负离子模式(ESI-); b)检测方式:多反应监测模式(MRM); c)离子源温度:550 ℃; d)雾化气:氮气,流速8 mL/min; e)气帘气:氮气,流速25 mL/min; f)碰撞气:氮气;流速50 mL/min; g)毛细管电压:22 V; 三、标准曲线的绘制 分别移取一系列混合标准工作溶液(4.18),按照浓度由低到高的顺序依据仪器条件(6.3.1)进行测定,以色谱峰峰面积为纵坐标,对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准工作曲线。 四、定性 按6.3.1的仪器条件对标准工作溶液和样品溶液进行测定,如果样品溶液中色谱峰的保留时间与标准物质色谱峰的保留时间一致;而且样品溶液中监测离子的相对丰度比与相当浓度的标准溶液的监测离子对的相对丰度比的偏差不超过表2的规定范围,则可判定样品中存在相应的目标成分。

一、规范性引用文件 《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》 二、原理 公英青蓝合剂中的金刚乙胺经稀释后,超高效液相色谱串联质谱测定,依据保留时间和离子丰度比定性,外标法定量。 三、仪器设备 1、高效液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI)。 2、分析天平:感量0.000 01 g。 3、离心机(5 000 r/min)。 四、高效液相色谱参考条件 1、色谱柱:C18色谱柱,50 mm×2.1 mm×1.7 μm,或性能相当者。 2、流动相A:甲醇(含0.1 %甲酸)。 3、流动相B:水溶液(含0.1 %甲酸)。 4、流速:0.3 mL/min。 5、进样量:10 μL。 6、柱温:35 ℃。 五、质谱参考条件 1、电离模式:电喷雾正离子(ESI+)。 2、毛细管电压:3 kv。 3、离子源温度:110 ℃。 4、脱溶剂温度:320 ℃。 5、脱溶剂氮气流速:550 L/h。 六、定性测定 通过样品溶液色谱图的保留时间与相应对照溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。样品溶液与对照溶液保留时间的相对偏差不大于2.5 %;样品溶液特征离子的相对离子丰度与对照溶液的相对离子丰度一致,相对离子丰度偏差不超过表3的规定,则可判断样品中存在金刚乙胺。 七、定量测定 取样品溶液和对照溶液各10 μL注入液相色谱-串联质谱仪,在上述色谱-质谱条件下进行测定,记录质量色谱图,外标法定量。

泰拉霉素含3个碱性的氨基基团,为弱碱性化合物,易溶于酸性溶液和极性溶剂中,在pH6~8的水溶液中较稳定,在酸性和碱性条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸不稳定性。据文献[3]报道,乙腈和甲醇是组织中大环内酯类药物常用的提取溶剂,且采用酸化的乙腈或甲醇为提取溶剂可促进大环内酯类抗生素从组织中溶出,改善提取效率。本实验比较了4种提取液:乙腈?0.1%偏磷酸(70∶30,V/V)、甲醇?0.1%偏磷酸(70∶30,V/V)、乙腈?0.1%磷酸(70∶30,V/V)和甲醇?0.1%磷酸(70∶30,V/V)对泰拉霉素的提取效果。结果表明,甲醇?0.1%磷酸(70∶30,V/V)提取液对泰拉霉素的提取效果较好,回收率高于其它提取液,故本实验选择甲醇?0.1%磷酸为样品提取液。液?液分配和固相萃取是大环内酯类药物的两种主要净化手段。液?液分配操作比较麻烦且回收率相对较低,重复性较差,所以本研究采用固相萃取技术净化。比较了C18、OasisMCX和PCX3种SPE净化小柱,由于OasisMCX小柱和PCX小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制,基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性,OasisMCX小柱和PCX小柱的净化效果优于C18小柱。OasisMCX小柱和PCX小柱提取效率没有明显差别,但PCX小柱成本低,所以,本方法选择PCX小柱。

Symmetry?C8柱(20mm 3.9mm,5 m),流动相:V∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱温:30℃,进样室温度15℃,进样量:10 L,流速为0.3mL/min.

由于大环内酯类药物的同位素内标物质很少,至今无泰拉霉素同位素内标物出售。而测定大环内酯类药物的检测方法研究和标准修制订一般采用外标法或者采用大环内酯类某种结构相似药物作为内标物来进行定量分析。本实验选用一种没有用于兽药用途且结构与泰拉霉素非常相似的大环内酯类药物罗红霉素作为内标,分子结构如图2所示。图2内标物罗红霉素分子结构式

3.2色谱与质谱条件的优化

添加溶液的配制:吸取储备液1mL于100mL容量瓶中并用V(0.05mol/LK2HPO4)∶V=75∶25混合液定容,再从中吸取1mL于50mL容量瓶中得添加液浓度为0.2mg/L(冰箱冷藏储存,有效期2个月)。

Fig.1Structureoftulathromycin在很多地区出现了不同程度的耐药性[3],而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物,因此,泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药,泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前,大环内酯类药物残留检测方法有ELISA筛选法[4]、薄层色谱法[5]、气质联用法[6]、高效液相色谱[7~10]和高效液相色谱串联质谱法等[11,12].有关泰拉霉素的残留检测研究较少[13].本研究建立了以罗红霉素(C41H76N2O15,837)为内标的泰拉霉素的HPLC?MS/MS检测方法,方法的定量限为10 g/kg,可以满足有关法规对大环内酯类药物的检测要求,为动物组织中泰拉霉素的残留监控提供技术支持。

电喷雾离子化方法容易受样品基质的影响。实验发现,样品基质对离子化有非常强的抑制作用。为消除样品基质效应,以待测样品制备对应的空白样品提取液,并以其作为标准溶液的稀释溶液,可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件。

3.2.1液相色谱条件的优化泰拉霉素是弱碱性和脂溶性的极性化合物,通过选择不同规格、不同填料的色谱柱和调节流动相中缓冲溶液的pH值、离子强度和有机溶剂的含量,从而控制泰拉霉素的离子化强度和溶解性,使其在色谱柱上获得适当的保留和有效的分离。本实验选用了Symmetry?C8柱(20mm 3.9mm,5 m),VenusilASBC18柱(30mm 2.1mm,5 m),XTerraMSC18柱(15mm 2.1mm,3.5 m)和XDB?C18柱(50mm 1.0mm,5 m)4种不同规格、不同填料的色谱柱进行实验。结果发现,选用Symmetry?C8色谱柱时,基线平稳,峰形对称,重现性好。流动相优化实验发现,当流动相为V∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30等度洗脱时,可使泰拉霉素在Symmetry?C8色谱柱上得到较好的分离效果和较高的灵敏度。

Fig.2Structureofroxithromycinasinternalstandard

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